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蛋白纯化问题

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黄金蛋

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发表于 2015-9-8 10:50:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

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我有一个新蛋白,跑胶检测主要在沉淀中,下一步应该怎么做才能使沉淀中的蛋白减少,好的蛋白增多,我是16度诱导过夜,下一步要降低诱导温度吗?增加裂解液的盐浓度?加点甘油?求解,谢谢!
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发表于 2015-9-8 13:47:19 | 显示全部楼层
你说的这些都是可以试试的,你还可以进行包涵体纯化(不是特别推荐),此外,你还可以导入分子伴侣一起表达能极大的提高你的蛋白可溶性的,这里你可以参见http://www.proteinscience.cn/for ... &extra=page%3D1  我有这些plasmid,你若需要,我可以提供给你。
最后就是,你确定你的蛋白domain完整不完整?这里就需要构建多个构建进行纯化测试了。
祝好~~~~
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发表于 2015-9-8 14:26:41 | 显示全部楼层
admin 发表于 2015-9-8 13:47
你说的这些都是可以试试的,你还可以进行包涵体纯化(不是特别推荐),此外,你还可以导入分子伴侣一起表达 ...

我也想要有分子伴侣的plasmid! 请问怎么能从坛主这儿拿到呢?
[发帖际遇]: jhtjs2015 讲文明,树新风,蛋白质科学网奖励其 4 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-9-8 14:29:22 | 显示全部楼层
首先原因可能是选的蛋白的性质不好啦。
建议的方法有降低表达温度,减少IPTG,测试合适的lysis buffer。
加tag比如GST-tag, 然后把tag切了。
如果有配体的话还应该加配体,比如Zn2+,Mg2+这类的,能帮助稳定蛋白。
[发帖际遇]: jhtjs2015 一个月就解出了一个蛋白质结构,大家共同奖励其 10 贡献,并表示“哎,不明觉厉啊!”. 幸运榜 / 衰神榜
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黄金蛋

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 楼主| 发表于 2015-9-8 15:51:33 | 显示全部楼层
分子伴侣一起表达虽然可能极大的提高蛋白可溶性的,但是后续会不会影响分离,与目的蛋白不容易分离,
[发帖际遇]: GOGO 很爱好问问题,不错,蛋白质科学网打赏其 4 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-9-8 16:26:58 | 显示全部楼层
GOGO 发表于 2015-9-8 15:51
分子伴侣一起表达虽然可能极大的提高蛋白可溶性的,但是后续会不会影响分离,与目的蛋白不容易分离, ...

不会,没多大影响。
[发帖际遇]: admin 不认真做实验,被蛋白质科学网扣了 8 蛋蛋. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-9-8 16:27:35 | 显示全部楼层
jhtjs2015 发表于 2015-9-8 14:26
我也想要有分子伴侣的plasmid! 请问怎么能从坛主这儿拿到呢?

可以啊,想要的话我可以邮寄给你,当然要你是在国内啊
[发帖际遇]: admin 乐于助人,奖励 3 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2018-4-13 09:49:49 | 显示全部楼层
您好!请问能把分子伴侣的质粒发一份给我吗?谢谢
[发帖际遇]: 2223153638 在敲键盘时没有注意,被小偷偷去了 4 蛋蛋. 幸运榜 / 衰神榜
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