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简单实用的PCR方法点突变protocol

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发表于 2015-8-27 08:43:58 | 显示全部楼层 |阅读模式

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       昨天又有一位蛋友问我有没有点突变的protocol,我再来抛砖引玉下,将自己点突变的protocol发出来。很多人都有各自的一套点突变方法,而我是使用PCR对载体直接进行环P,然后切胶去模板,再连接转化,发给大家,供大家参考,交流,拍砖。

点突变protocol.docx

53.04 KB, 下载次数: 37

PCR介导的点突变方法

[发帖际遇]: admin 非常用功读书,蛋白质科学网代表主席奖励其 2 贡献,并表示“为中华崛起而读书”. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-8-27 10:46:59 | 显示全部楼层
谢谢。
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 楼主| 发表于 2015-8-27 10:50:25 | 显示全部楼层

不客气
[发帖际遇]: admin实验记录写的一丝不苟,蛋白质科学网奖励10 贡献,并带来爱迪生的话“良好的实验记录,是灵感的来源”. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-8-27 10:56:58 | 显示全部楼层
一直用overlap突变的路过。。
[发帖际遇]: a86052 在敲键盘时没有注意,被小偷偷去了 2 蛋蛋. 幸运榜 / 衰神榜
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 楼主| 发表于 2015-8-27 11:02:54 | 显示全部楼层
a86052 发表于 2015-8-27 10:56
一直用overlap突变的路过。。

我的抛砖引玉有效果啊。能简单介绍下不
[发帖际遇]: admin 很爱好问问题,不错,蛋白质科学网打赏其 7 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-8-27 16:31:07 | 显示全部楼层
本帖最后由 a86052 于 2015-8-27 16:40 编辑
admin 发表于 2015-8-27 11:02
我的抛砖引玉有效果啊。能简单介绍下不。

额,这个overlap是个笨方法,比较麻烦,不过个人感觉成功率还是蛮高的,比较简单的现在有突变试剂盒,盒子里有protocol,基本流程也是设计一对带有突变位点的引物,将质粒整个P出来,然后消化掉模板质粒,再进行转化。overlap突变方法要进行两次PCR,示意图如下
overlap_mutation.jpg


引物F'、R'中包含了突变位点,F、R为正常的引物。主要步骤:a. 以引物F/R'和F'/R分别进行PCR,并分别回收产物;b.以回收的两个产物为模板,用引物F/R进行PCR,并回收产物;c.限制酶切、连接、转化。



[发帖际遇]: a86052实验记录写的一丝不苟,蛋白质科学网奖励4 贡献,并带来爱迪生的话“良好的实验记录,是灵感的来源”. 幸运榜 / 衰神榜
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 楼主| 发表于 2015-8-27 16:41:40 | 显示全部楼层
a86052 发表于 2015-8-27 16:31
额,这个overlap是个笨方法,比较麻烦,不过个人感觉成功率还是蛮高的,比较简单的现在有突变试剂盒,盒 ...

哦,这样子。那以回收的两个产物作为模板,使用F/R进行PCR的时候,两个产物是按照什么比例混啊?取多少量作为模板?
[发帖际遇]: admin 为实验室解除了一次火灾隐患,蛋白质科学网奖励其 3 贡献,并表示“安全第一,实验第二啊”. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-8-27 16:48:31 | 显示全部楼层
admin 发表于 2015-8-27 16:41
哦,这样子。那以回收的两个产物作为模板,使用F/R进行PCR的时候,两个产物是按照什么比例混啊?取多少量 ...

1:1取就行了。量的话看你第一次PCR的情况,正常情况下取个1 ul(100 ng)左右就可以了,确切的浓度没测过
[发帖际遇]: a86052 乐于助人,奖励 2 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
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 楼主| 发表于 2015-8-27 16:58:43 | 显示全部楼层
a86052 发表于 2015-8-27 16:48
1:1取就行了。量的话看你第一次PCR的情况,正常情况下取个1 ul(100 ng)左右就可以了,确切的浓度没测过 ...

明白了,好方法,就是P很长的片段时候也是使用这种方法了?
[发帖际遇]: 楼主很高兴,赏赐 admin10 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
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发表于 2015-8-27 17:07:23 | 显示全部楼层
admin 发表于 2015-8-27 16:58
明白了,好方法,就是P很长的片段时候也是使用这种方法了?

很长,你指多少以上?我做过的蛋白不大,基因长度1500bp,我用这个方法突变过。
[发帖际遇]: 一个袋子砸在了 a86052 头上,a86052 赚了 2 蛋蛋. 幸运榜 / 衰神榜
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