蛋白质科学网

 找回密码
 注册
查看: 173|回复: 13
收起左侧

硒代蛋白表达量太少无法得到蛋白怎么办

[复制链接]

8

主题

150

帖子

3万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
32142
QQ
发表于 2017-7-9 22:03:59 | 显示全部楼层 |阅读模式

马上注册,共享更多资源。

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?注册

x
如题。有一300aa蛋白,含有2个甲硫氨酸,母体蛋白表达量约2mg/L,做硒代表达表达量很低而且很杂,无法纯化出来,怎么办
[发帖际遇]: a86052 发表论文了,大家奖励其 8 贡献,并“喜大普奔”. 幸运榜 / 衰神榜
XY2
回复

使用道具 举报

25

主题

115

帖子

1万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
15401
发表于 2017-7-9 22:51:05 | 显示全部楼层
试过泡重金属了吗?我个人觉得泡重金属更方便省事。
[发帖际遇]: muheifeng 查阅资料很仔细,蛋白质科学网奖励其 5 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
回复 支持 反对

使用道具 举报

6

主题

328

帖子

8万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
82642
QQ
发表于 2017-7-10 07:41:07 | 显示全部楼层
扩大体积和降低表达温度试试。而且Met的数量有点偏少了吧。
实在不行就表达native的蛋白然后试试重金属
[发帖际遇]: jhtjs2015 查阅资料很仔细,蛋白质科学网奖励其 7 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
回复 支持 反对

使用道具 举报

2

主题

21

帖子

1936

积分

水蛋

Rank: 3Rank: 3

积分
1936
发表于 2017-7-12 07:09:15 | 显示全部楼层
的确MET数量有些偏少啊。你做硒代时诱导时候OD是多少?菌摇多久摇起来的?菌体经过了活化吗?
[发帖际遇]: choice 乐于助人,奖励 9 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
回复 支持 反对

使用道具 举报

8

主题

150

帖子

3万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
32142
QQ
 楼主| 发表于 2017-7-12 13:02:28 | 显示全部楼层
muheifeng 发表于 2017-7-9 22:51
试过泡重金属了吗?我个人觉得泡重金属更方便省事。

已然泡过了,但是需要大量机时去测数据。。。上海光源这月就要关。。。唉

[发帖际遇]: a86052 刚刚帮助警察抓小偷了,被奖励 5 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
XY2
回复 支持 反对

使用道具 举报

8

主题

150

帖子

3万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
32142
QQ
 楼主| 发表于 2017-7-12 13:03:11 | 显示全部楼层
jhtjs2015 发表于 2017-7-10 07:41
扩大体积和降低表达温度试试。而且Met的数量有点偏少了吧。
实在不行就表达native的蛋白然后试试重金属 ...

嗯,泡重原子了

[发帖际遇]: a86052 发表论文了,大家奖励其 9 贡献,并“喜大普奔”. 幸运榜 / 衰神榜
XY2
回复 支持 反对

使用道具 举报

8

主题

150

帖子

3万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
32142
QQ
 楼主| 发表于 2017-7-12 13:04:53 | 显示全部楼层
choice 发表于 2017-7-12 07:09
的确MET数量有些偏少啊。你做硒代时诱导时候OD是多少?菌摇多久摇起来的?菌体经过了活化吗? ...

诱导时OD有0.6-0.8吧,摇8h左右吧,菌是新转化的。也通过突变引入了新的MET,但是表达都很惨淡。。。

[发帖际遇]: a86052 很爱好问问题,不错,蛋白质科学网打赏其 5 贡献. 幸运榜 / 衰神榜
XY2
回复 支持 反对

使用道具 举报

2

主题

21

帖子

1936

积分

水蛋

Rank: 3Rank: 3

积分
1936
发表于 2017-7-13 07:19:26 | 显示全部楼层
a86052 发表于 2017-7-12 13:04
诱导时OD有0.6-0.8吧,摇8h左右吧,菌是新转化的。也通过突变引入了新的MET,但是表达都很惨淡。。。

...

多挑些单克隆做一些试表达吧,有可能能挑选出表达量高的克隆的,我以前的情况就是这样。
再就是,多活化几次,就是接到少量到几毫升的minimal media后,摇到OD 0.6-0.8再重新转接一次到几毫升新的minimal media当中。
经过3-4次左右的活化,菌株活力达到最强,表达也会强些的。
[发帖际遇]: choice被人举报昨天说了脏话XXXX,被有关部门扣 3 蛋蛋. 幸运榜 / 衰神榜
回复 支持 反对

使用道具 举报

2

主题

21

帖子

1936

积分

水蛋

Rank: 3Rank: 3

积分
1936
发表于 2017-7-13 07:26:20 | 显示全部楼层
试一试8度 ,36h的表达条件。
[发帖际遇]: choice 为实验室解除了一次火灾隐患,蛋白质科学网奖励其 6 贡献,并表示“安全第一,实验第二啊”. 幸运榜 / 衰神榜
回复 支持 反对

使用道具 举报

8

主题

150

帖子

3万

积分

版主

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
32142
QQ
 楼主| 发表于 2017-7-13 12:29:47 | 显示全部楼层
choice 发表于 2017-7-13 07:19
多挑些单克隆做一些试表达吧,有可能能挑选出表达量高的克隆的,我以前的情况就是这样。
再就是,多活化 ...

好的~

[发帖际遇]: a86052 一个月就解出了一个蛋白质结构,大家共同奖励其 8 贡献,并表示“哎,不明觉厉啊!”. 幸运榜 / 衰神榜
XY2
回复 支持 反对

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 注册

本版积分规则

QQ|Archiver|手机版|蛋白质科学网 ( 沪ICP备15022641号

GMT+8, 2017-10-24 00:48 , Processed in 0.390345 second(s), 38 queries .

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表